黃曲霉毒素B1免疫親和柱操作說明書

【概要】

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃分為1類致癌物，同時又是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，廣泛存在于各種食物中。玉米，花生，大米，小麥等谷物及其副產(chǎn)品是黃曲霉毒素的主要來源，同時飼料中的黃曲霉毒素B1經(jīng)過動物代謝后產(chǎn)生的黃曲霉毒素M1仍然具有很強的毒性和致癌性，也廣泛存在牛奶，血液，組織等食品中。黃曲霉毒素作為肝癌的三大誘因之一，也是誘發(fā)胃癌，腸癌等疾病的主要原因之一，對人類的健康構(gòu)成很大威脅。世界各國對食品，飼料中的黃曲霉毒素都有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。

【適用范圍及性能】

用于定性、定量檢測谷物、副食品、酒類等食品和飼料等樣本中的黃曲霉毒素總量B1時的樣品前處理。

柱容量：≥200ng

回收率：≥90%

【試驗原理】

本產(chǎn)品的測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，黃曲霉毒素B1單克隆抗體連接在柱內(nèi)凝膠上，樣品中的黃曲霉毒素B1經(jīng)過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢的通過黃曲霉毒素B1免疫親和層析柱，在免疫親和柱內(nèi)，毒素與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其他物質(zhì)。用甲醇洗脫黃曲霉毒素B1，然后注入到分析儀器中用于檢測。

【包裝組成】

根據(jù)不同規(guī)格，每一個盒中包含5-25支黃曲霉毒素免疫親和層析柱及1份說明書。

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

┅┅高速均質(zhì)器或組織勻漿機

┅┅粉碎機

┅┅200ml/50ml量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅微量移液器：單道 100?l～1000?l

┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）

┅┅玻璃微纖維濾紙（1.5?m孔徑）

┅┅50ml漏斗

┅┅一次性玻璃試管

┅┅泵流操作架（包括空氣泵，不同容積的玻璃注射器等）

試劑：

┅┅甲醇（色譜級）

┅┅蒸餾水或去離子水

┅┅pH7.0磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL

┅┅吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000mL

【試劑配制】

樣品提取液：根據(jù)不同的樣品配置不同濃度的甲醇水溶液，作為樣品提取液。

【樣本處理步驟】

（一）花生，玉米，大米，小麥及其制品，植物油脂和飼料

┅┅取25g粉碎的樣品（植物油脂直接取樣，無需處理）與125mL甲醇-水（7：3）溶液混合；

┅┅加入5.0g氯化鈉以均質(zhì)器高速攪拌，提取2分鐘；

┅┅4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；

┅┅取15mL濾液并加入30mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾，取稀釋后液體待測；

┅┅將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取15.0mL樣品提取液注入玻璃注射器；

┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體；

┅┅準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

（二）醬油

┅┅取50g試樣與100mL甲醇-水（8：2）溶液混合；

┅┅加入2.5g氯化鈉以均質(zhì)器高速攪拌，提取1分鐘；

┅┅4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；

┅┅取10mL濾液并加入40mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾

┅┅取稀釋后液體待測；

┅┅將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL樣品提取液注入玻璃注射器；

┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體；

┅┅準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

（三）食醋

┅┅取5g試樣，加入1.0g氯化鈉；

┅┅以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋定容至25.0mL；

┅┅4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；

┅┅取10mL濾液并加入10mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾

┅┅取稀釋后液體待測。

┅┅將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL樣品提取液注入玻璃注射器；

┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體；

┅┅準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

【結(jié)果判定】

經(jīng)免疫親和柱凈化后，收集到的甲醇洗脫液可直接使用熒光計或者HPLC檢測，也可使用薄層色譜或者酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測。收集到的1mL洗脫液中的黃曲霉毒素B1含量相當(dāng)于1g樣品中黃曲霉毒素B1含量。

【高效液相參考譜圖】

【注意事項】

┅┅黃曲霉毒素危害極大，應(yīng)戴手套操作。

┅┅使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液最好用5%濃度次氯酸鈉溶液浸泡過夜。

┅┅不要使用過了有效日期的免疫親和柱。

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：親和柱可于常溫保存，2-8℃儲存可延長有效期，不可凍存

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。